TBE یا Tris / Borate / EDTA ، یک محلول بافر است که شامل مخلوطی از باز Tris ، اسید بوریک و EDTA است. در زیست شناسی مولکولی ، از بافر TBE و TAE معمولاً در روشهای مربوط به اسیدهای نوکلئیک استفاده می شود که رایج ترین آنها الکتروفورز است . EDTA یک عامل کلاتور کاتیون های دو ظرفیتی به ویژه منیزیم (Mg 2+ ) است ، از آنجا که این یونها روی عملکرد بسیاری از آنزیمها از جمله نوکلئازهای آلاینده، مؤثر هستند ، نقش EDTA در محافظت از اسیدهای نوکلئیک در برابر تخریب آنزیمی پررنگ می شود. اما از آنجا که Mg 2+ برای بسیاری از آنزیمهای مفید برای اصلاح DNA مانند آنزیمهای محدود کننده و پلیمرازهای DNA نیز عامل مهمی است ، غلظت کمی از آن در بافرهای TBE یا TAE وجود دارد (معمولاً در حدود 1 میلی مولار ).
کاربرد های بافر TBE
در بیولوژی مولکولی ، از بافر TBE برای الکتروفورز در ژل آگارز و یا پلی آکریل آمید به طور معمول برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک (یعنی DNA و RNA) استفاده می شود. این بافر نه تنها در الکتروفورز اسید نوکلئیک ژل آگارز و پلی آکریل آمید بلکه در آماده سازی ژل آگارز و پلی آکریل آمید نیز مورد استفاده قرار می گیرد. بافر TBE همچنین برای تجزیه و تحلیل قطعات DNA در دستگاه PCR ، پروتکل های جداسازی DNA یا آزمایش های کلون سازی DNA کاربرد دارد.
همچنین برای جدا کردن قطعات DNA کوچکتر (کمتر از 1500باز) مانند محصولات کوچک هضم آنزیم محدود مفید مناسب است. بافر TBE از ظرفیت بافر بیشتری برخوردار است و وضوح بیشتری نسبت به بافر TAE خواهد داشت. بافر TBE به طور کلی گران تر از TAE است و DNA لیزاز را مهار می کند ، در صورتی که در مراحل بعدی تصفیه DNA و لیزینگ باید در نظر داشت ممکن است مشکلاتی ایجاد کند.
تفاوت بین بافر TAE و TBE و خواص آنها در الکتروفورز ژل آگارز چیست؟
بافر TAE به عنوان یک بافر در حال اجرا و در ژل آگارز مورد استفاده قرار می گیرد. استفاده از آن در دفع روشهای الکتروفورز ژنتیکی و شیب برای آنالیز جهش دامنه نیز مرسوم است. از TAE در غلظتهای مختلف برای بررسی تحرک DNA در محلول با و بدون کلرید سدیم استفاده شده است. با این حال ، غلظت بالای کلرید سدیم (و بسیاری از نمکهای دیگر) در یک نمونه DNA تحرک آن را مهار می کند. این ممکن است به تفسیر نادرست از الگوی باندینگ DNA منجر شود.
در مقایسه با بافر TBE ، بافر TAE مزایای کاربردهای آنزیمی متعاقب آن را برای نمونه DNA ارائه می دهد. به عنوان مثال ، اگر از یک نمونه DNA در آزمایش کلونینگ استفاده می شود ، مرحله ای که در حال اجرا بر روی ژل آگارز است ، پیوند زدن (پیوند کووالانسی) به یک بردار کلونینگ (به احتمال زیاد یک پلاسمید) است. نمونه DNA از TAE Buffer برای این منظور مناسب است ، در حالی که DNA در بافر TBE مناسب نیست.
با این حال Borate موجود در بافر TBE یک مهار کننده قوی برای بسیاری از آنزیم ها است. این خاصیت مهارکننده آنزیم باعث شده است که بافر TBE به دو دلیل در قلمرو خود بسیار محبوب شود. ابتدا ، یک نمونه DNA که با یک بافر TBE اجرا می شود ، می تواند بهتر حفظ شود. دلیل اصلی دیگر این است که هدف بسیاری از الکتروفورزهای ژل آگارز تجزیه و تحلیل اندازه مولکولهای DNA است.
ساخت و تهیه این بافر
برای ایجاد این ماده ، فقط به چهار ماده نیاز دارید. موارد باقیمانده در این لیست تجهیزات هستند. چهار ماده مورد نیاز نمک سدیم EDTA ، باز تریس ، اسید بوریک و آب دیونیزه شده است.
در مورد تجهیزات ، به pH سنج و کالیبراسیون احتیاج دارید. علاوه بر این ، شما برخی از ظرف های 600 میلی لیتری و 1500 میلی لیتری یا فلاسک ها را تهیه کنید. تجهیزات مورد نیاز را جمع کنید .
موجودی را در آزمایشگاه مورد استفاده خود بررسی کنید تا اطمینان حاصل کنید که قبل از شروع کار ، همه چیز مورد نیاز را دارید. هیچ چیز بدتر از متوقف شدن وسط تهیه بافر TBE نیست زیرا شما از مواد مناسب استفاده کردید.
اگر آزمایشگاه شما در مدرسه است یا محل کار شما ، با پرسنل مناسب بررسی کنید تا ببینید که تمام موارد موجود در انبار را دارند. با انجام این کار ممکن است در پایان زمان و انرژی شما صرفه جویی شود.
*وزن فرمول با اختصار FW است. این وزن اتمی یک عنصر است که با تعداد اتم های هر عنصر در یک فرمول ضرب می شود ، سپس تمام جرم های هر عنصر را با هم جمع می کنند.
محلول EDTA
محلول EDTA باید پیش از موعد تهیه شود. تا زمانی که pH در حدود 8.0 تنظیم نشود ، EDTA کاملاً وارد محلول نخواهد شد. برای تهیه ی 500 میلی لیتراز محلول نیم مولار EDTA ، 93.05 گرم نمک دی سدیم EDTA را وزن کنید (FW = 372.2). سپس آن را در 400 میلی لیتر آب دیونیزه حل کرده و pH را با هیدروکسید سدیم (NaOH) تنظیم کنید. پس از آن ، محلول را به حجم نهایی 500 میلی لیتر برسانید.
تهیه محلول بافر 5X TBE
محلول غلیظ 5X TBE را با وزن 54 گرم باز تریس (FW = 121.14) و 27.5 گرم اسید بوریک (FW = 61.83) تهیه کرده و هر دو را تقریباً در 900 میلی لیتر آب دیونیزه حل کنید. سپس 20 میلی لیتراز محلول 0.5 مولار EDTA (pH 8.0) را اضافه کرده و محلول را به حجم نهایی 1 لیتر برسانید. این محلول در دمای اتاق قابل ذخیره است اما رسوب در محلولهای قدیمی تشکیل می شود. بافر را در بطری های شیشه ای ذخیره کرده و در صورت تشکیل رسوب ، آن را دور بیندازید.
تهیه ی محلول بافر 0.5X TBE
برای الکتروفورز ژل آگارز می توان از بافر TBE با غلظت0.5X ) رقت 1:10 از محلول غلیظ) استفاده کرد. محلول 5X TBE را 10 برابر در آب دیونیزه رقیق کنید. اکنون بافر آماده استفاده برای اجرای ژل آگارز است.
تهیه ی محلول بافر 10X TBE
TBE Buffer (10X) یک محلول آبی با 0.89مول تریس ، 0،89 مول اسید بوریک و 0.2مولار EDTA است که با آب فوق خالص تهیه شده است.
عوارض بافر TBE
مهمترین علائم و عوارض بافر TBE، تحریک پوست و چشم است. خطرات ویژه ناشی از ماده یا مخلوط تجزیه حرارتی این ماده می تواند منجر به آزاد شدن گازها و بخارهای تحریک کننده شود.
