الکتروفورز

الکتروفورز (از یونانیηλεκτροφόρηση  به معنی “تحمل الکترون”) حرکت ذرات پراکنده نسبت به یک سیال تحت تأثیر یک میدان الکتریکی یکنواخت است. الکتروفورز ذرات با بار مثبت (کاتیونها) گاهی اوقات کاتافورز نامیده می شود ، در حالی که گاهی اوقات الکتروفورز ذرات با بار منفی (آنیون ها) گاهی آنافورز نامیده می شود.

پدیده الکتروکینتیکی الکتروفورز برای اولین بار در سال 1807 توسط اساتید روسی پیتر ایوانوویچ استراخوف و فردیناند فردریک ریوس در دانشگاه ایالتی مسکو مشاهده شد که متوجه شدند استفاده از یک میدان الکتریکی ثابت باعث شده است که ذرات رس در آب پخش شوند. در نهایت به دلیل وجود یک رابط شارژ شده بین سطح ذرات و مایع اطراف آن ایجاد می شود. این پایه ای برای تکنیک های تحلیلی است که در شیمی برای جداسازی مولکول ها بر اساس اندازه ، بار و یا وابستگی به کار می رود.

الکتروفورز در آزمایشگاه ها برای جدا کردن ماکرومولکول ها بر اساس اندازه استفاده می شود. این روش بار منفی را اعمال می کند بنابراین پروتئین ها به سمت یک بار مثبت حرکت می کنند. الکتروفورز به طور گسترده در آنالیز پروتئین و DNA ، RNA  استفاده می شود.

 

تئوری الکتروفورز‌

ذرات معلق دارای بار الکتریکی سطح هستند ، که به شدت تحت تأثیر گونه های جذب سطحی قرار می گیرند ، که یک میدان الکتریکی خارجی از آن استفاده می کند. مطابق نظریه دو لایه ، تمام بارهای سطحی در مایعات توسط یک لایه پراکنده از یونها نمایش داده می شوند که دارای بار مطلق اما علامت مخالف با توجه به بار سطح هستند. میدان الکتریکی همچنین در لایه پراکنده یونی را اعمال می کند که دارای جهت خلاف عمل بر روی بار سطح است.

این نیروی دوم در واقع بر روی ذره اعمال نمی شود بلکه به یون های موجود در لایه پراکنده واقع در فاصله کمی از سطح ذرات می پردازد و بخشی از آن از طریق تنش چسبناک به تمام قسمت ها به سطح ذرات منتقل می شود. به این قسمت از نیرو نیز نیروی عقب ماندگی الکتروفورز گفته می شود. هنگامی که میدان الکتریکی اعمال می شود و ذره ای که باید آنالیز شود ، از طریق لایه پراکنده در حرکت ثابت است ، کل نیروی حاصل صفر است:

با توجه به کشیدن ذرات متحرک به دلیل ویسکوزیته پراکندگی ، در مورد کم بودن رینولدز و قدرت میدان الکتریکی متوسط ​​E ، سرعت رانش یک ذره پراکنده v به سادگی متناسب با میدان کاربردی است ، که باعث تحرک الکتروفورز می شود. μe به عنوان  تعریف شده است:

معروف ترین و پرکاربردترین تئوری الکتروفورز در سال 1903 توسط اسمولوچوفسکی توسعه یافت:

بطوریکه که εr ثابت دی الکتریک محیط پراکندگی است ، ε0 تراکم فضای خالی (C 1 N ² 1 متر m 2) ، η ویسکوزیته پویا از محیط پراکندگی (Pa)  ، و ζ پتانسیل zeta(به عنوان مثال پتانسیل الکتروکینتیکی هواپیمای لغزش در لایه دوبل ، واحدهای mV یا V) است.

نظریه Smoluchowski

نظریه Smoluchowski بسیار قدرتمند است زیرا برای ذرات پراکنده از هر شکل و در هر غلظت کار می کند. اعتبار آن محدودیت هایی دارد. به عنوان مثال ، زیر به این دلیل که طول Debye κ − 1 (واحد متر) را شامل نمی شود. با این حال ، طول Debye باید برای الکتروفورز مهم باشد ، به شرح زیر بلافاصله از شکل سمت راست. افزایش ضخامت لایه دوبل (DL) منجر به از بین بردن نقطه نیروی عقب ماندگی بیشتر از سطح ذرات می شود. هرچه DL ضخیم تر باشد ، نیروی عقب ماندگی نیز کوچکتر است.

تجزیه و تحلیل نظری دقیق نشان داد که تئوری Smoluchowski فقط برای DL به اندازه کافی نازک معتبر است ، هنگامی که شعاع ذرات a بسیار بزرگتر از طول Debye است:

این مدل “دو لایه نازک” نه تنها برای تئوری الکتروفورز بلکه برای بسیاری از تئوری های الکتروکینتیک ساده سازی های شگرفی را ارائه می دهد. این مدل برای اکثر سیستم های آبی معتبر است ، جایی که طول Debye معمولاً تنها چند نانومتر است. این تنها برای نانو کلوئیدها در محلول با قدرت یونی نزدیک به آب می شکند.

 

نظریه اسمولوچوفسکی همچنین از سهم ناشی از هدایت سطحی صرف نظر می کند. این در تئوری مدرن به عنوان شرط مقدار کوچک دوخین بیان شده است:

در تلاش برای گسترش دامنه اعتبار نظریه های الکتروفورز ، موارد بدون علامت مخالف در نظر گرفته شد ، هنگامی که طول دبویه از شعاع ذرات بزرگتر است:

تحت این شرایط “دو لایه ضخیم” ، هاکل رابطه زیر را برای تحرک الکتروفورز پیش بینی کرد:

این مدل می تواند برای بعضی از نانوذرات و مایعات غیر قطبی مفید باشد ، جایی که طول Debye بسیار بزرگتر از موارد معمول است.

 

چندین تئوری تحلیلی وجود دارد که هدایت سطحی را در بر می گیرد و محدودیت تعداد کوچکی از Dukhin را که توسط Overbeek پیشگام شده است از بین می برد. نظریه های مدرن و سختگیرانه که برای هر پتانسیل زتا معتبر است و غالباً هرگونه آک ریشه ای عمدتاً از نظریه دوخین-سمنیخین به دست می آید.

در نظریه دو لایه نازک ، این تئوری ها راه حل عددی برای مسئله ارائه شده توسط اوبراین و وایت را تأیید می کنند.

 

الکتروفورز ژل

الکتروفورز ژل روشی برای جداسازی و تجزیه و تحلیل ماکرومولکول ها (DNA ، RNA و پروتئین ها) و قطعاتشان با توجه به اندازه و بار آن ها است. در شیمی بالینی برای جداسازی پروتئین ها توسط بار یا اندازه استفاده می شود (آگاروز IEF ، اساساً اندازه مستقل) و در بیوشیمی و زیست شناسی مولکولی برای جدا کردن جمعیت ترکیبی از قطعات DNA و RNA به طول ، برای برآورد اندازه قطعات DNA و RNA یا پروتئین ها را با بار جدا کنید.

مولکولهای اسید نوکلئیک با استفاده از یک میدان الکتریکی از هم جدا می شوند و مولکولهای با بار منفی از طریق ماتریس آگارز یا سایر مواد منتقل می شوند. مولکولهای کوتاهتر سریعتر حرکت می کنند و دورتر از سلولهای بزرگ تر مهاجرت می کنند زیرا مولکولهای کوتاهتر با سهولت بیشتری در منافذ ژل حرکت می کنند. این پدیده غربال نامیده می شود. پروتئین ها به طور بارزی در آگارز از هم جدا می شوند زیرا منافذ ژل برای غربال پروتئین بسیار بزرگ هستند. از الکتروفورز ژل نیز می توان برای جداسازی نانوذرات استفاده کرد.

در الکتروفورز ژل از ژل به عنوان یک ماده ضد انعقادی یا یک ماده غربال کننده در حین الکتروفورز ، برای حرکت یک ذره باردار در یک میدان الکتریکی استفاده می کنند. ژلها همرفت حرارتی ناشی از استفاده از میدان الکتریکی را سرکوب می کنند ، و همچنین می توانند به عنوان یک وسیله غربالگری عمل کنند و بتوانند گذر از مولکول ها را عقب بیندازند. ژل ها همچنین به سادگی می توانند برای حفظ جداسازی به پایان برسند ، به طوری که می توان از لکه الکتروفورز پست استفاده کرد. الکتروفورز DNA ژل معمولاً برای اهداف تحلیلی انجام می شود ، اغلب پس از تکثیر DNA از طریق واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) ، اما ممکن است قبل از استفاده از روش های دیگر مانند طیف سنجی جرمی ، RFLP ، PCR ، کلونینگ ، توالی DNA به عنوان یک روش آماده سازی استفاده شود.

 

مبنای فیزیکی الکتروفورز ژل

بررسی اجمالی الکتروفورز ژل

به عبارت ساده ، الکتروفورز فرایندی است که مرتب سازی مولکول ها را بر اساس اندازه امکان پذیر می کند. با استفاده از یک میدان الکتریکی ، می توان مولکول هایی (مانند DNA) را وادار ساخت تا از طریق ژل ساخته شده از آگارز یا پلی آکریل آمید حرکت کنند. میدان الکتریکی از یک بار منفی در یک انتها تشکیل شده است که مولکول ها را از طریق ژل هل می دهد و یک بار مثبت در انتهای دیگر که مولکول ها را از طریق ژل می کشد.

مولکولهای طبقه بندی شده در یک ماده ژل به داخل چاه منتقل می شوند. ژل در یک محفظه الکتروفورز قرار می گیرد ، که سپس به یک منبع انرژی وصل می شود. هنگامی که جریان الکتریکی اعمال شود ، مولکولهای بزرگتر کندتر از طریق ژل حرکت می کنند در حالی که مولکول های کوچکتر سریعتر حرکت می کنند. مولکول های با اندازه های مختلف نوارهای مشخصی را روی ژل تشکیل می دهند.

 

اصطلاح “ژل” در این مثال به ماتریس استفاده شده برای مهار ، و سپس جدا کردن مولکولهای هدف اشاره دارد. در بیشتر موارد ، ژل پلیمر به صورت متقاطع است که ترکیب و تخلخل آن بر اساس وزن و ترکیب خاص هدف مورد نظر انتخاب می شود. هنگام جدا کردن پروتئین ها یا اسیدهای نوکلئیک کوچک (DNA ، RNA یا الیگونوکلئوتیدها) ژل معمولاً از غلظت های مختلف آکریل امید و یک اتصال دهنده متقاطع تشکیل شده و شبکه های مختلفی با اندازه های مختلف پلی آکریل آمید تولید می کند.

هنگام جدا کردن اسیدهای نوکلئیک بزرگتر (بیشتر از چند صد باز) ، ماتریس ترجیحی آگارز خالص است. در هر دو حالت ، ژل یک ماتریس جامد و در عین حال متخلخل را تشکیل می دهد. آکریل آمید ، بر خلاف پلی آکریل آمید ، یک نوروتوکسین است و برای جلوگیری از مسمومیت باید با استفاده از اقدامات احتیاطی مناسب انجام شود. آگارز از زنجیره های طولانی کربوهیدرات بدون بار و بدون پیوند متقاطع تشکیل شده است و در نتیجه ژلی با منافذ بزرگ امکان جداسازی ماکرومولکول ها و مجتمع های ماکرومولکولی را فراهم می کند.

 

الکتروفورز به نیروی الکتروموتور (EMF) اطلاق می شود که برای انتقال مولکول ها از طریق ماتریس ژل استفاده می شود. با قرار دادن مولکول ها در چاه های موجود در ژل و استفاده از یک میدان الکتریکی ، این مولکول ها با سرعت های مختلف از طریق ماتریس حرکت می کنند که تا حد یکنواخت نسبت بار به جرم (Z) از همه گونه ها تعیین می شود. با این حال ، هنگامی که بارها همه یکنواخت نیستند ، میدان الکتریکی تولید شده با روش الکتروفورز باعث می شود که مولکولها با توجه به بار متفاوت ، مهاجرت کنند.

گونه هایی که دارای بار خالص مثبت هستند به سمت کاتدی که دارای بار منفی است مهاجرت می کنند (زیرا این یک الکترولیت است و نه سلول گالوانی) ، در حالی که گونه هایی که دارای بار منفی خالص هستند به سمت آند با بار مثبت مهاجرت می کنند. جرم عاملی در سرعت است که با استفاده از این مولکولهای شارژ نشده به طور یکنواخت از طریق ماتریس به سمت الکترودهای مربوطه خود حرکت می کنند.

 

اگر چند نمونه در ژل در چاه های مجاور بارگذاری شده باشد ، آنها به صورت موازی در خطوط جداگانه اجرا می شوند. بسته به تعداد مولکولهای مختلف ، هر خط اجزای مختلف جداشده از مخلوط اصلی را به عنوان یک یا چند باند مجزا ، یک باند برای هر مؤلفه نشان می دهد.

جداسازی ناقص اجزاء می تواند منجر به ایجاد باند های همپوشانی یا لکه های غیر قابل تشخیص شود که چندین مؤلفه حل نشده را نشان می دهند. که معمولاً تقریباً به همین اندازه است. نشانگرهای اندازه گیری وزن مولکولی موجود است که شامل ترکیبی از مولکول های اندازه های شناخته شده است. اگر چنین نشانگر بر روی یک خط در ژل به موازات نمونه های ناشناخته اجرا شود ، می توان باند های مشاهده شده را برای تعیین اندازه آنها با موارد ناشناخته مقایسه کرد. مسافتی که یک باند طی می کند تقریباً با معکوس لگاریتم اندازه مولکول متناسب است.

محدودیت هایی در تکنیک های الکتروفورز وجود دارد. از آنجا که عبور جریان از طریق ژل باعث گرم شدن می شود ، ممکن است در طول الکتروفورز ژل ها ذوب شوند. الکتروفورز در محلول های بافر برای کاهش تغییرات pH در اثر میدان الکتریکی انجام می شود ، این مهم است زیرا بار DNA و RNA به pH بستگی دارد ، اما اجرای بیش از حد طولانی می تواند ظرفیت بافر محلول را تخلیه کند. همچنین در تعیین وزن مولکولی توسط SDS-PAGE محدودیت هایی وجود دارد ، به خصوص هنگام تلاش برای یافتن MW یک پروتئین ناشناخته. متغیرهای بیولوژیکی خاصی وجود دارد که به حداقل رساندن آنها دشوار یا غیرممکن است و می توانند بر مهاجرت الکتروفورز تأثیر بگذارند.

چنین عواملی شامل ساختار پروتئین ، تغییرات پس از ترجمه و ترکیب اسید آمینه است. به عنوان مثال ، تروپومیوزین یک پروتئین اسیدی است که به طور غیر طبیعی بر روی ژل های SDS-PAGE مهاجرت می کند. این امر به این دلیل است که باقیمانده اسیدی توسط SDS با بار منفی دفع می شود و منجر به یک نسبت نادرست از جرم به بار و مهاجرت می شود. علاوه بر این ، آماده سازی های مختلف از مواد ژنتیکی ممکن است به دلایل مورفولوژیکی یا دلایل دیگر به طور مداوم با یکدیگر مهاجرت نکنند.

انواع ژل

انواع ژل هایی که معمولاً مورد استفاده قرار می گیرند ، ژل های آگارز و پلی آکریل آمید هستند. هر نوع ژل از نظر انواع و اندازه های مختلف آنالیز مناسب است. ژلهای پلی آکریل آمید معمولاً برای پروتئین ها استفاده می شوند و برای قطعات کوچک DNA (5-500 جفت باز) قدرت حل کننده بسیار بالایی دارند. از طرف دیگر ژلهای آگارز قدرت تعیین کننده کمتری برای DNA دارند اما دامنه جدایی بیشتری دارند و از این رو برای قطعات DNA معمولاً در اندازه 50 تا 20 هزار جفت باز استفاده می شود ، اما با استفاده از الکتروفورز ژل میدان پالس (PFGE) رزولوشن بالای 6 مگاباز امکان پذیر است.

ژلهای پلی آکریل آمید در یک پیکربندی عمودی اجرا می شوند در حالی که ژل های آگارز به طور معمول به صورت افقی اجرا می شوند. آنها همچنین در روش ریخته گری خود متفاوت هستند ، زیرا آگارز از نظر حرارتی تنظیم می شود ، در حالی که پلی اکریل آمید در یک واکنش پلیمریزاسیون شیمیایی تشکیل می شود.

آگارز

ژل های آگارز از پلیمرهای طبیعی پلی ساکارید استخراج شده از جلبک دریایی تهیه می شوند. ژل های آگارز به راحتی در مقایسه با سایر ماتریس ها ریخته می شوند و با آنها برخورد می شود زیرا تنظیم ژل به جای تغییر شیمیایی یک فرایند فیزیکی است. نمونه ها نیز به راحتی بازیابی می شوند. پس از پایان آزمایش ، ژل حاصل می تواند در یک کیسه پلاستیکی در یخچال نگهداری شود.

 

ژل های آگارز اندازه منافذ یکنواخت ندارند ، اما برای الکتروفورز پروتئین هایی که بزرگتر از 200 کیلو دالتون هستند بهینه هستند. از الکتروفورز ژل آگارز نیز می توان برای جداسازی قطعات DNA اعم از 50 جفت باز گرفته تا چند مگاباز (میلیون ها جفت باز) استفاده کرد که بزرگترین آنها به دستگاه تخصصی نیاز دارد. فاصله بین باند های DNA با طول های مختلف تحت تأثیر درصد آگارز موجود در ژل قرار دارد ، درصورتی که درصد بیشتر نیاز به زمان اجرای بیشتر دارند . در عوض ، ژلهای آگارز درصد بالا باید با الکتروفورز میدان پالسی (PFE) یا الکتروفورز وارونگی میدانی اجرا شوند.

 

“بیشتر ژلهای آگارز با  0.7٪ (جداسازی خوب یا وضوح قطعات بزرگ DNA 5-10 کیلوباز) تا 2٪ (وضوح خوب برای قطعات کوچک 0.2 تا 1 کیلوباز) آگارز حل شده در بافر الکتروفورز ساخته می شود.  و حداکثر 3٪ از آن می تواند برای جدا کردن قطعات بسیار ریز بکار رود اما ژل پلی آکریل آمید عمودی در این مورد مناسب تر است. ژل های درصد کم بسیار ضعیف هستند و ممکن است در هنگام بلند کردن آنها شکسته شوند. ژل های با درصد بالا غالبا شکننده هستند و به طور مساوی تنظیم نمی شوند. ژل های  1٪  معمولی هستند.

اگر درباره آگارز و پودر آگارز میخواهید بیشتر بدانید میتوانید آن را در وبلاگ ما مشاهده کنید و برای دیدن قیمت های این ماده به سایت اصلی ما مراجعه کنید

پلی آکریل آمید

الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (PAGE) به دلیل اندازه یکنواخت منافذ ارائه شده توسط ژل پلی آکریل آمید برای جداسازی پروتئین ها به اندازه 5 تا 2000 کیلو دالتون مورد استفاده قرار می گیرد. اندازه منافذ با تعدیل غلظت آکریل آمید و پودر بیس اکریلامید مورد استفاده در ایجاد ژل کنترل می شود. در ایجاد این نوع ژل باید  احتیاط کرد زیرا آکریل آمید یک نوروتوکسین قوی به شکل مایع و پودری است.

 

تکنیک های تعیین توالی DNA از قبیل روش های Maxam-Gilbert یا Sanger از ژل های پلی آکریل آمید برای جدا کردن قطعات DNA متفاوت با طول یک جفت باز متفاوت استفاده می شود تا ترتیب آن خوانده شود. امروزه در اکثر روشهای جداسازی DNA از ژل آگارز استفاده می کنند ، بجز برای قطعات DNA کوچک. در حال حاضر اغلب در زمینه ایمونولوژی و آنالیز پروتئین مورد استفاده قرار می گیرد ، که اغلب برای جدا کردن پروتئین ها یا ایزوفرم های مختلف یک پروتئین در باند جداگانه استفاده می شود. اینها را می توان به یک غشای نیتروسلولوز یا PVDF منتقل کرد تا با آنتی بادی و نشانگرهای مربوطه مانند در یک وسترن بلات بررسی شود.

 

ژل های حل کننده معمولاً در 6٪ ، 8٪ ، 10٪ ، 12٪ یا 15٪ ساخته می شوند. ژل انباشته (5٪) در بالای ژل حل کننده و یک شانه ژل ریخته می شود (که چاه ها را تشکیل می دهد و خط هایی را تعیین می کند که پروتئین ها ، بافر نمونه و نردبان ها در آن قرار داده شده است). درصد انتخابی بستگی به اندازه پروتئینی دارد که مایل به شناسایی یا بررسی در نمونه است. هرچه وزن شناخته شده کوچکتر باشد ، درصدی که باید استفاده شود بیشتر است. تغییرات در سیستم بافر ژل می تواند به رفع بیشتر پروتئین ها در اندازه های بسیار کوچک کمک کند.

مطالعه بیشتر درباره ی آکریل آمید

نشاسته

نشاسته سیب زمینی تا حدی هیدرولیز شده باعث ایجاد یک ماده غیر سمی دیگر برای الکتروفورز پروتئین می شود. ژل ها کمی مات تر از آکریل آمید یا آگارز هستند. پروتئین های غیر دناتوره شده با توجه به بار و اندازه می توانند از هم جدا شوند. آنها با استفاده از رنگ آمیزی Napthal Black یا Amido Black تجسم می شوند. غلظت ژل نشاسته معمولی 5٪ تا 10٪ می باشد.

شرایط ژل

دناتوراسیون

 

پروفایل TTGE نمایانگر تنوع بیفیدوباکتریایی نمونه های مدفوعی از دو داوطلب سالم (A و B) قبل و بعد از درمانAMC (اسید آموکسی سیلین-کلوولانیک اسید خوراکی) ژلهای دناتوره شده در شرایطی اجرا می شوند که ساختار طبیعی آنالیز را مختل می کند و باعث می شود تا به زنجیره ای خطی باز شود. بنابراین ، تحرک هر ماکرومول فقط به طول خطی و نسبت جرم به بار آن بستگی دارد. بنابراین ، سطح ثانویه ، سوم و چهارم ساختار بیومولکولی مختل می شود و تنها ساختار اولیه را مورد تجزیه و تحلیل قرار می دهد.

اسیدهای نوکلئیک غالباً با وارد آمدن اوره در بافر دناتوره می شوند ، در حالی که پروتئین ها با استفاده از سدیم دودسیل سولفات ، معمولاً به عنوان بخشی از فرآیند SDS-PAGE ، با استفاده از سدیم دناتوره می شوند. برای دناتوراسیون کامل پروتئین ها ، همچنین لازم است که پیوندهای دی سولفید کووالانسی که باعث ثبات در ساختار سوم و کواترنر آنها می شود ، کاهش یابد ، روشی به نام کاهش PAGE. کاهش شرایط معمولاً با افزودن بتا-مرکاپتواتانول یا دییتیوتریتول حفظ می شود. برای تجزیه و تحلیل کلی نمونه های پروتئین ، کاهش PAGE رایج ترین شکل الکتروفورز پروتئین است.

برای تخمین مناسب وزن مولکولی RNA ، شرایط دناتوره کردن ضروری است. RNA قادر به ایجاد فعل و انفعالات درون مولکولی بیشتر از DNA است که ممکن است منجر به تغییر تحرک الکتروفورز آن شود. اوره ، DMSO و گلیوکسال رایج ترین عوامل دناته کننده برای ایجاد اختلال در ساختار RNA هستند.

در الکتروفورز ژل از دناتوره کردن در روش های مبتنی بر الگوی DNA و RNA بکار می رود.

بومی سازی

ژل های بومی در شرایط غیر جبران کننده بدن اجرا می شوند ، به طوری که ساختار طبیعی آنالیت حفظ می شود. این اجازه می دهد تا اندازه فیزیکی مجموعه تاشو یا مونتاژ شده بر تحرک تأثیر بگذارد ، و تجزیه و تحلیل هر چهار سطح ساختار بیومکلی را امکان پذیر می کند. برای نمونه های بیولوژیکی ، از مواد شوینده فقط به حدی استفاده می شود که برای لیز شدن غشاهای لیپیدی در سلول لازم باشد. مجتمعها در بیشتر مواقع در ارتباط هستند و به همان اندازه که در سلول قرار می گیرند ، باقی می مانند. با این وجود ، نکته منفی این است که مجتمعها ممکن است تمیز یا قابل پیش بینی از هم جدا نشوند ، زیرا پیش بینی اینکه شکل و اندازه مولکول چه تاثیری بر تحرک آن خواهد داشت دشوار است. پرداختن و حل این مشکل یک هدف اصلی از PAGE بومی کمی است.

بر خلاف روش های دناتوره کردن ، الکتروفورز ژل بومی از یک عامل دناتوره کننده شارژ استفاده نمی کند. بنابراین مولکولهای جدا شده (معمولاً پروتئینها یا اسیدهای نوکلئیک) نه تنها در جرم مولکولی و بار ذاتی بلکه در سطح مقطعی تفاوت دارند و بنابراین نیروهای مختلف الکتروفورز را به شکل ساختار کلی وابسته می کنند. برای پروتئین ها ، از آنجا که در حالت بومی باقی می مانند ، ممکن است نه تنها با معرف رنگ آمیزی پروتئین ، بلکه با رنگ آمیزی خاص مربوط به آنزیم نیز قابل تجسم باشند.

یک نمونه آزمایش خاص از کاربرد الکتروفورز ژل بومی بررسی فعالیت آنزیمی برای تأیید حضور آنزیم در نمونه در طی تصفیه پروتئین است. به عنوان مثال ، برای پروتئین قلیایی فسفاتاز ، محلول رنگ آمیزی ترکیبی از نمک 4-کلرو-2-2 متیل بنزن دیازونی با نمک 3-فسفو-2-نفتوئیک اسید-2-4-دی متیل آنیلین در بافر تریس است. این لکه از نظر تجاری به عنوان کیت برای رنگ آمیزی ژل ها به فروش می رسد.

در صورت وجود پروتئین ، مکانیسم واکنش به ترتیب زیر اتفاق می افتد: با دفع فسفوریلاسیون 3-فسفو-2-نفتالیو اسید-2′-4′-دی متیل آنیلین توسط قلیایی فسفاتاز (آب مورد نیاز است) شروع می شود. برای واکنش) گروه فسفات آزاد شده و توسط یک گروه الکلی از آب جایگزین می شود. الکتروفییل 4- کلرو -2- متیل بنزن دیازونیوم (نمک سریع قرمز قرمز دیازونیوم) گروه الکل را تشکیل می دهد که محصول نهایی رنگ قرمز آزو را تشکیل می دهد. همانطور که از نام آن پیداست ، این محصول نهایی قابل مشاهده-قرمز واکنش است. در آزمایش های دانشگاهی برای تمیز کردن پروتئین ، ژل معمولاً به منظور تجسم نتایج و نتیجه گیری در مورد موفقیت آمیز بودن یا عدم موفقیت ، در کنار نمونه های خالص تجاری اجرا می شود.

الکتروفورز ژل بومی به طور معمول در پروتئومیکس و فلز استفاده می شود. با این حال ، PAGE بومی نیز برای اسکن ژن (DNA) برای جهش های ناشناخته همانطور که در پلی مورفیسم ترکیب تک رشته ای وجود دارد ، استفاده می شود.

الکتروفورز ژل و DNA

الکتروفورز شما را قادر می سازد قطعات DNA با طول های مختلف را تشخیص دهید.

DNA بار منفی دارد ، بنابراین ، هنگامی که یک جریان الکتریکی به ژل اعمال می شود ، DNA به سمت الکترود با بار مثبت منتقل می شود.

رشته های DNA کوتاه تر نسبت به رشته های طولانی تر سریعتر از طریق ژل حرکت می کنند و باعث می شوند قطعات به ترتیب اندازه مرتب شوند.

برچسب ها DNA موجود در ژل را قادر می سازند پس از جدا شدن ، دیده شوند. آنها به صورت نوارهایی روی ژل ظاهر می شوند.

یک نشانگر DNA با قطعاتی از طول شناخته شده معمولاً همزمان با نمونه ها از طریق ژل انجام می شود.

با مقایسه باند نمونه های DNA با نمونه های نشانگر DNA ، می توانید طول تقریبی قطعات DNA را در نمونه ها مشخص کنید.

تهیه ژل

ژل های آگارز بطور معمول برای تجسم بخش هایی از DNA استفاده می شوند. غلظت آگارز مورد استفاده در ساخت ژل بستگی به اندازه قطعات DNA ای دارد که با آنها کار می کنید.

هرچه غلظت آگارز بیشتر باشد ، ماتریس متراکم تر است و برعکس. قطعات کوچکتر DNA بر روی غلظت های بالاتر آگارز از هم جدا می شوند در حالی که مولکول های بزرگتر نیاز به غلظت کمتری از آگارز دارند.

برای تهیه ژل ، پودر آگارز با یک بافر الکتروفورز مخلوط می شود و تا دمای زیادی گرم می شود تا اینکه تمام پودر آگارز ذوب شود.

سپس ژل مذاب را درون یک سینی ریخته گری ریخته می شود و یک “شانه” در یک انتها قرار داده می شود تا چاه هایی برای نمونه در داخل آن قرار بگیرد.

پس از خنک شدن و استحکام ژل (اکنون به جای آنکه روشن باشد مات خواهد بود) شانه برداشته می شود.

اکنون بسیاری از افراد از ژلهای از پیش ساخته استفاده می کنند.

سپس ژل را درون مخزن الکتروفورز قرار می دهیم و بافر الکتروفورز درون مخزن ریخته می شود تا سطح ژل پوشانده شود. بافر جریان الکتریکی را انجام می دهد. نوع بافر مورد استفاده بستگی به اندازه تقریبی قطعات DNA در نمونه دارد.

 

تهیه DNA برای الکتروفورز

قبل از الکتروفورز ، یک رنگ برای افزایش ویسکوزیته به نمونه DNA اضافه می شود که مانع خروج آن از چاه ها می شود و به این ترتیب می توان مهاجرت نمونه را از طریق ژل مشاهده کرد.

یک نشانگر DNA  (که به عنوان استاندارد اندازه یا نردبان DNA نیز شناخته می شود) در چاه اول ژل بارگذاری می شود. قطعات موجود در نشانگر از طول مشخصی برخوردار هستند ، بنابراین می توان برای کمک به تقریب اندازه قطعات در نمونه ها استفاده کرد.

سپس نمونه های DNA آماده شده به درون چاههای باقیمانده ژل پیوند زده می شوند.

هنگامی که این کار انجام شد ، درب روی مخزن الکتروفورز قرار می گیرد تا اطمینان حاصل شود که جهت گیری ژل و الکترودهای مثبت و منفی صحیح است (می خواهیم DNA از طریق ژل به انتهای مثبت منتقل شود).

جداسازی قطعات

سپس جریان الکتریکی وصل می شود به طوری که  DNA  با بار منفی از طریق ژل به سمت قطب مثبت حرکت می کند.

طول DNA کوتاهتر در زمان طولانی تری حرکت می کند بنابراین باید زمان اجرای جریان را بیشتر کرد.

تصویر سازی نتایج

هنگامی که DNA به اندازه کافی در ژل حرکت کرد ، جریان الکتریکی قطع می شود و ژل از مخزن الکتروفورز خارج می شود.

برای تصویرسازی DNA ، این ژل با یک رنگ فلورسنت که به DNA متصل می شود ، آغشته می شود و روی یک ترانسفرمینال ماوراء بنفش قرار می گیرد که DNA رنگ آمیزی را به عنوان باند روشن نشان می دهد.

از طرف دیگر رنگ می تواند قبل از ریختن با ژل مخلوط شود.

اگر ژل به درستی اجرا شده باشد ، الگوی باندینگ استاندارد DNA نشانگر / اندازه قابل مشاهده خواهد بود.

سپس می توان با تصور کردن یک خط افقی که از میان باندهای نشانگر DNA در حال عبور است ، اندازه DNA را در نمونه خود قضاوت کرد. سپس می توانید اندازه DNA را در نمونه با مطابقت آنها با نزدیکترین باند در نشانگر تخمین بزنید.

طول قطعات DNA با یک نشانگر حاوی قطعات با طول شناخته شده مقایسه می شود.

 

الکتروفورز پروتئین

پروتئین ها بار منفی ندارند و به همین دلیل نمی توان با استفاده از یک میدان الکتریکی آن ها را از هم جدا کرد. برای غلبه بر این مسئله ، مواد شوینده سدیم ددسیل سولفات به منظور جداسازی پروتئین ها با استفاده از الکتروفورز ژل به محلول پروتئین اضافه می شود. این درمان باعث می شود پروتئین ها در حالی که آنها را با یک لایه منفی منفی پوشانده ، به شکل خطی باز شوند. این روکش منفی به پروتئین ها اجازه می دهد تا به سمت انتهای مثبت ژل منتقل شوند و بنابراین با توجه به وزن مولکولی از یکدیگر جدا می شوند.

در حالی که قطعات DNA را می توان بلافاصله در زیر چراغهای UV مشاهده کرد ، قطعات پروتئینی باید با آنتی بادی های هدفمند مشخص شوند ، فرایندی که به عنوان سیستم ایمنی بدن شناخته می شود. این واکنش نمی تواند روی بستر ژل اتفاق بیفتد. پروتئین ها باید بر روی غشایی (عمدتا PVDF یا نیتروسلولوز) منتقل شوند و سپس با محلول حاوی آنتی بادی که به طور مشخص پروتئین مورد علاقه را تشخیص داده و به هم می پیوندند ، لخته شوند.

منابع :

https://en.wikipedia.org/wiki/Electrophoresis

https://en.wikipedia.org/wiki/Gel_electrophoresis

https://www.yourgenome.org/facts/what-is-gel-electrophoresis

https://www.expedeon.com/resources/applications/introduction-to-dna-and-protein-gel-electrophoresis/